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▼今実験でうまくいかないこと▼パート7▼

1 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/04(土) 18:18:41
いま実験でうまくいかないことスレッドです。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。

★過去スレ★
 いま実験でうまくいかないことスレッド
  http://cheese.2ch.net/life/kako/967/967541407.html
 ▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
  http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/
 ▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
  http://science2.2ch.net/life/kako/1026/10263/1026312578.html
 ▼今実験でうまくいかないこと▼パート4▼
  http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1093050850/
 ▼今実験でうまくいかないこと▼パート5▼
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1121097197/
 ▼今実験で上手くいかない事を質問するスレ▼ part6
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1146716446/

☆主な関連スレ☆
 ◆生物学専門家への質問はここに書き込めPart22◆
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1162375329/
 ◆2ch高校生のための生物質問板 7時間目◆
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1161079191/
 質問に対して小学生でもわかる回答をするスレの3
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1145937037/
 タンパク質の精製3
  http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1104733094/

2 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/05(日) 10:18:22
新調したばかりの靴に、E.coli零したorz

3 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/05(日) 12:26:36
オスバン部隊 出動!

4 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/05(日) 19:33:44
>>2

(・∀・)つ http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1048661187/l50
{実験}悲しいとき〜

5 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 00:03:25
どうも。前スレでRT-PCR生成物を発現ベクターにクローニングできずに困っていてここで
相談させて頂き、 pCR-Blunt II-TOPO を勧めていただいた者です。

お陰様でcDNAのTOPOクローニングはできたのですが、切り出して発現ベクターに入れると、
制限酵素2種類使っているのに、おかしな配列を伴って逆向きに入ったものだけが生き残り
ます(拾ったコロニーについて)。

培地には抗生物質の他に1%グルコースを入れています。
大腸菌はNovaBlueの他にHB101株を使ってみました。
プライマーも再合成したものを使っています(長さを短くしました)。

なにか他に策はありませんでしょうか。

形質転換の後、向きが分かるようなコロニーPCRでスクリーニングしまくれば数撃てば当たり
ますでしょうか。。

ちなみに目的蛋白質は、ほ乳類の分泌蛋白質で、シグナル配列を除去した領域に対応するcDNAに
制限酵素配列を付けて増幅し、pETベクターの大腸菌用のシグナル配列を付けようとしています。
また、分泌後、他の蛋白質と複合体を作って1つの機能を持ちます。相手方はペリプラスムに
安定して発現しています。

6 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 02:23:11
プラスミドに入れたDNAのシーケンスで、プラスミドの標準的な
プライマー(インサート配列を挟むフォワードとリバース)の片方
ではきれいに読めるのに、もう片方はぐちゃぐちゃで全く読めない
んですが、どんな原因が考えられますか?

7 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 08:47:24
漏れも同じ問題が…

8 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 08:59:37
>>6
プラスミドの濃度が最適値から外れている。

9 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 09:14:06
ナメクジのパッチクランプ

10 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 09:29:35
>>5
培養は全て30℃にする。

11 :5:2006/11/08(水) 11:20:47
>>10
ありがとうございます。
ライゲーション・形質転換後のSOC培養以降、全て30℃ですね。
やってみます。

30℃だと、SOC培地、LBプレート(+ Glc, Kan)の培養時間はどのくらい長くなるでしょう?

12 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 15:02:00
>>6 プライマーがアニールしそうな配列がインサートにある。
3' 9merが相同で読めない経験あり。

13 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 22:33:10
スレ違いだと思うがどうしても納得いかんので聞いて欲しい

「吸光度の単位はnm(ナノメートル)だよw」って自信満々のパートナーに見下す感じで言われた。
これ間違ってますよね?

14 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 23:10:14
無名数じゃね?

15 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 23:27:55
Arbitrary Unit

16 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 23:49:59
>>13
そりゃ「そのサンプルがその吸光度を示した時の波長」だな。
吸光度は無次元数じゃろ?



・・・正直あまり自信ないです、ハイ。

17 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 01:00:59
培養に関しての疑問なんだけど、高密度培養による産生物収率の向上の原因って何?

18 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 03:34:20
nm = nautical mile (海里)

19 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 20:07:23
ABIの310でPOP6のままジーンスキャンやってるんだけどなかなかうまく行きません。
モジュールの設定とかどうすればいいか知ってる人いますか?

20 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 21:18:19
>>13
http://www.youtube.com/watch?v=0umpeN2uJbY

21 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 21:54:11
吸光度:

光路長一定のとき、ある波長と等しいエネルギーを持った光子が
試料中に吸収される比率。単位は無次元([J/J])。

吸収された光子のエネルギーは、分子の振動や化学反応などに
利用された後、長波長の電磁波として放出されるため、
通常の吸光度計では検出できない。

22 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/10(金) 14:52:57
>12
サンクス。
調べてみたら、シーケンス用にメーカーが売ってるプライマーでも、
意外にアニールしそうな別の配列があるもんですね(しかもベクター部分!)。

23 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/13(月) 13:22:02
おまいら、ディスポのチャコールマスクって、どっち向きにはめてる?
漏れは黒い面が口の方になるように当ててるけど、先輩は「それだと口が黒くなる」
と言って白い面が口になるようにはめてます。
そうすると見た目がかなりかっこわるく見えるんだけど。。黒くなったこともないし。

24 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/13(月) 22:08:32
てゆーか
防塵マスクってひらべったくないだろ


25 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 01:13:10
>>23
http://www.hagitec.co.jp/hagiten/as/as8/as1303.htm#2
☆使用上の注意:装着する際は、黒い面を外側に白い面を顔側に装着してください。

26 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 04:41:54

20bp程度のオリゴを細胞内に導入する実験をしているのですが、エレクトロポレーションだと細胞が死んでしまったりして
うまくいきません。
できるだけ効率よく核内まで導入する方法って何でしょうか?


27 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 18:45:09
酵素のpH依存性を調べるために
酸性フォスファターゼでp-ニトロフェニルリン酸を加水分解したいんですが

実験書には、基質液に塩化マグネシウムを入れるように書いてあるのです。
これって入れる必要性が無いと思うのです・・・
皆様の御意見をお聞かせください

28 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 20:24:44
>>27
じゃあ入れなければ良いじゃん

29 :27:2006/11/14(火) 21:45:31
>>28
分かりました...orz
どうもすみませんでした

30 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 23:27:13
>>27
なぜ、必要ないと思った?

31 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/15(水) 01:03:35
スレ違いだったらごめぬなさい。
ゼミで教授にEカドヘリン消失を介さない上皮間葉移行(epithelial to mesenchymal transition)は存在するのか調査を任命されました。
つまり、Eカドヘリンを発現していない上皮細胞は存在するのか?
EMT後にもEカドヘリンを発現している間葉系細胞はあるのか?
そんな報告があるのでしょうか?
自分では探しきれず、誰か詳しいヒト教えてくさい!!

32 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/15(水) 01:14:46
>>31
こんなところで人に頼っているのを教授が見たら泣くぞ

33 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/15(水) 08:17:50
ヲマイ、PCの前から離れるときはURL履歴を消しとけwwwww

34 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/16(木) 00:15:03
>>31
>ゼミで教授にEカドヘリン消失を介さない上皮間葉移行(epithelial to mesenchymal transition)は
>存在するのか調査を任命されました。

おまい、これでここで質問ってのはなしだわ・・・

35 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/16(木) 21:38:39
クローニングベクターに入った遺伝子を、制限酵素で切り出してゲル精製、
発現用のベクターに入れようとしています。

なぜか、とれたプラスミドはもとのサブクローンしたDNAのままでした。

何故なんでしょう??

36 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 00:47:10
制限酵素の切れ残りがコンタミしたんじゃねーの?
スーパーコイルの出てくる位置とインサートの位置は十分離れてるのか?
クローニングベクターと発現ベクターの耐性遺伝子は別?
カネあるならGatewayにするとつなぎかえの悩みはなくなる
マジおすすめ

37 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 01:48:14
俺だったらインサート切らずにベクターのみ切る酵素でさらに切ってみるだろうな

38 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 07:38:43
>>34
なんだ 知らないのか・・・ププwww

39 :31:2006/11/17(金) 10:37:10
>>32, 33, 34
そうすね
やっぱり自分で探してみまっす
厳しいお言葉産休

40 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 14:04:07
ここにはカメの専門家はいらっしゃいますか?

臨床家なのですが、今度ひょんなことから
ミドリガメをsacrifyして血液検査(PCR)をすることになりました。
ミドリガメからの採血の方法をご存知の方がいらっしゃいましたら
教えていただけないでしょうか。

41 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 14:10:24
>>35
情報不足。
(1)クローニングベクターのサイズ(bp)と、
 その切り出しに使用した制限酵素の名前とゲル精製後のサイズ
(2)発現用ベクターのサイズと、
 その切り出しに使用した制限酵素の名前ととゲル精製後のサイズ

これを教えれ。
とくに(1)の切り出しにひとつの制限酵素を使用した場合や
ふたつの制限酵素を使用した場合でもXbaIとSpeIなど
compatible endsとなる酵素対を使用した場合は
そのようにself ligationを起こす可能性が高くなるので、
mol比を1:3〜1:5くらいにするなど、注意が必要。

42 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 14:23:20
>>40
この板にいるのかな。獣医さんの領域だよね。。

43 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 16:43:01
制限酵素配列付きのプライマーでPCRした生成物をTOPOクローニングしたんですけど、
とれたものは、TOPOクローニングサイトではなく、まるで普通に切り貼りしたかのよ
うに制限酵素部位にインサートが入ったものだった、なんてことってありますか?

44 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 16:51:48
俺は聞いたことも体験したこともない。
あと考えてみたことも無い。シーケンス確認したらそうなってたの?

45 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 19:51:05
>>43
PCRの鋳型か何かがにプラスミドがコンタミしてたっていうオチじゃなくて?

46 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 20:11:30
Gatewayを使っています。
DESTベクターで哺乳動物細胞に目的遺伝子を発現させて機能解析をしようと思ってるんですが、
遺伝子導入の際のmock controlは何を用いればいいんでしょう?
最初は空ベクターにすべきかと思ったんですが、そうするとベクターがある程度の量必要になり
ますが、インサートを持ってないDESTベクターは大腸菌では増やせませんよね?

47 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 00:00:51
現在ウェスタンによってあるタンパク質の増減を見ています
しかし抗体が良くないのか4℃ O/NしてABC染色してやっと見れるかどうかという感じです

それでもちゃんと見れるならまだいいのですが、ポジコンでもバンドの位置が微妙にずれたり変なノンスペが目的バンドより濃く出たり普通はリン酸化の影響でダブレットで出るはずの目的バンドがシングルバンドで出たりともう無茶苦茶です
ポジコンには以前に多めに調製した細胞破砕液を小分けして使っているのでサンプル自体は同じでゲルの濃度等も同じです

このような現象の起こる原因及び対処法があれば教えてくださいお願いします

48 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 00:08:43
>>43
そんなはずあるわけないだろ。誰かのいたずらか>>45の言うとおりだ。

49 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 00:17:22
>>46
お前のラボではDESTベクターは使い切ったら新たに購入してるのか?
金持ってるんだなw


50 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 01:42:52
うちなんかdestination vectorはみんな手作りだぜ。

51 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 04:26:08
InvitrogenのpcDNA3.1/zeoベクターにインサートいれようとしてるんですが、
このときフレームを考えて設計しないといけないんでしょうか?
GSTベクターのようにフレームを合わせるのはこのベクターの場合ない?
またコザック配列を含ませろと書いてあったんだけど、どんな配列をどのように含ませるの?


52 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 08:07:24
悪いことは言わないから、まず分子生物の基礎から勉強しろ。

53 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 09:14:51
>>51
必要ないよ。

KOZAKは。。。。
ど忘れしたな。GCCACC(ATG)G (ATGはスタートコドン)だったかな?
間違っていたらどなたかフォローたのんます。

54 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 09:23:17
おしいな
ATGの5'側はAがたくさん並んでてー3あたりにC/Aが正解

55 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 14:34:00
おれは今まで50種類くらい(長さは200−2000aa)作ったけど、
>>53の配列(GCCACCATG)で発現しなかったことないよ。
コンセンサスには入ってるけど、ATGの後のGは経験的にはいらないと
思ってる。


56 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 21:18:31
来月からBACのショットガンシークエンスを始める予定ですが、
目標は何倍くらい読めばいいのでしょうか。


57 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 21:41:49
うへー時代はそこまで来ているのか。
にちゃんでショットガンシークエンス計画立てるようなやつがでてくるとは。
ttp://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1355857&rev=1
ここでは2-10倍と言ってるが。

58 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 23:39:36
>>49
>お前のラボではDESTベクターは使い切ったら新たに購入してるのか?
>金持ってるんだなw

え・・・マジで使い切るたびに購入してましたが・・・。
あれって増やせるんですか?
増やせないと思ってたので・・・。
どうやって増やしたらいいんですか?
普通に何かの大腸菌に入れて振盪培養?
抗生物質は何を?

ちなみに、お金は余ってます。

59 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 01:51:30
destなんて、6μ程度で4〜5万で買えるじゃん?

60 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 02:35:47
シーケンスがうまくいきません


61 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 03:13:32
お客様の中にエスパーの方はいらっしゃいますか?

62 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 03:33:30
>>60
君が下手
組成ミス
プライマー設計が怪しい
鋳型精製が汚い
機械の中の人の機嫌が悪い

63 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 07:36:10
>>58
じゃあどうやってvector作ると考えていたのか?
まあいいよ、マニュアルさえ読まず、
原理を理解していないような奴は、
国民の税金を無駄にinvitrogenに渡しておいてくれ。
いや俺はおそらく君と違う国にいるから。

と言いたいが、この業界を一緒くたに批判されて被害を被るのもなんだし、
ttp://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/C7510-03_001.shtml
こいつを買うのだ。
どうせこれ買ってもコンピ手作りはしないだろうが。
説明するとR12サイトに挟まれた所にあるccdBという遺伝子は、
普通の大腸菌を殺すが、この特殊なストレインはccdBに耐性で、
だから増えるという事だ。
もちろん暇があったらccdBが何をコードしていて、
このストレインがなぜ耐性なのか、知っておいてもそんはないかもしれん。

64 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 08:17:28
こういう先輩の下に付けたら幸せだったなぁ。。。

65 :51:2006/11/19(日) 14:05:19
>>53
>>54
>>55 サンクス
自分なりに調べてみたら、GCCACCATGGが必要とか、ACCATGGとか、CACCATGGとかでてるんだけどどれが正解?
>>53, >>55が言うようにGCCACCATGGが一番基本どおりなの?
ところでもひとつ、目的タンパクの前にコザック配列をつけるということだけど、コザック配列直後に目的タンパク配列を入れるの?
それか気持ち何塩基か余計に付けた後?
それともコザック配列中のATGと目的タンパクのATGは一緒にするの(Gも付けないといけないのにそれはないよね)?

66 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 17:30:37
>>63
親切だな、お前w
>>58のラボは金があるのはいいけど、助手も大学院生もポスドクもそろって
マニュアルも読まずに実験してるのか?
代理店やinvitrogenの営業は何も言ってこなかったの?
黙って入荷し続けたその代理店と取引するのはやめた方がいいと思うw

67 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 17:33:41
>>65
目的タンパクのATGをそのまま使えばOK
未知のものや膜タンパク質はN末端に変な配列ごちゃごちゃ
つけたり、アミノ酸変えたりしない方がいい。
ATGのあとのGはアミノ酸が変わるときはつけていない。
問題発生したことはないよ。

68 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 20:25:53
エチブロが怖いです

69 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 23:45:06
>>63
>説明するとR12サイトに挟まれた所にあるccdBという遺伝子は、
>普通の大腸菌を殺すが、この特殊なストレインはccdBに耐性で、
>だから増えるという事だ。
おぉ!こんなモノがあろうとは!
テラアリガタス(´・ω・`)ノ
早速買ってみます。

>>66
>>58のラボは金があるのはいいけど、助手も大学院生もポスドクもそろって
>マニュアルも読まずに実験してるのか?
>代理店やinvitrogenの営業は何も言ってこなかったの?
いわゆるMolecularの実験やってるのは俺ぐらいなので。。
マニュアルは必要な箇所だけ拾い読みしてました。
代理店は何も。。

70 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 03:16:21
>>68
ぶっちゃけ、手についてもきれいに洗えばおk
気になるなら、ゴム手お勧め

71 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 15:33:49
>>69
悪いこといわないから代理店を変えろ
ふざけるな、変えるぞとごねるだけでも何かいいことがあるかもw


72 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 21:48:54
>>70
手袋つけてるから平気でエチブロに触る
         ↓
そのままドアノブや機器やらを触る

っていう感じでうちの研究室では明らかに逆効果なんだが

73 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 22:20:49
発光バクテリアの培養が上手くいかないよ(ノД`)
なんでだろう?もう3回くらいやってるのに全部駄目。
雑菌に負けてしまったんだろうか。

74 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 23:06:46

これは質問なのか、それとも独白か?

75 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 04:40:12
>>72
エチブロ専用のゴム手か、使い捨ての手袋にするといい。
エツブロ触った後は、即廃棄

76 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 09:21:39
>>73 発光バクテリアってなんだろ?
海ホタルとかそうだっけ?

77 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 09:32:30
>>74
出来ればアドバイスを頂きたいです
>>76
イカの体表面に付着しているバクテリアのことです。
イカが夜光るのはその発光バクテリアのおかげなんだそうな。

培養するとペトリ皿の中で他の雑菌に負けて死滅してるorz


78 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 10:48:52
素人?
あるいはここには海洋微生物専門家は少ないと知っての愚痴か。
まずは単離からだろうね。

79 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 11:08:16
>>77
培地は何種類か試したのか?

80 :51:2006/11/22(水) 02:14:59
>>67
つまりは配列のあたまにGCCACCをただくっつければいいということですな。
ありがとう

81 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 15:27:49
突っ込んだ遺伝子を発現させようと、
BL21(DE3)pLysのグリセロールストックから起こして培養したけど菌が増えないorz
これって、リゾチームのせいでグリセロールストックは厳禁?
それともグリセロール20%じゃいかんのか。う〜ん

82 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 17:23:41
w

83 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 18:38:44
>>81
本来なら増えるだろ。
抗生物質の種類間違ったとかじゃなくて?

84 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 19:04:27
エタ沈がとてつもなく苦手です
昨日もロスしました
制限酵素処理したあと酵素を熱で失活させればエタ沈しなくてそのまま
トランスフェクションしても大丈夫ですか?
やっぱりやった方がいい?

85 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 19:07:47
>>83
プレートのアンピシリンがダメになってて、変なコロニー拾ったかも知れません。
もう一度試してみます。

86 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 19:32:56
>>84
それはトランスフェクションが上手くいかない理由としてエタ沈だと考えているの?
その他のミスとかはまず無いということか?
>>83の言うような抗生剤を間違えているとか
そもそもプラスミドが無いとか
その辺の確認はしているの?

87 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 19:57:25
>>86
はい、プラスミドの有無と抗生剤の確認はしました。

88 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 20:05:32
>>86
>>84ですが、エタ沈の前後でABS280ががた落ちするんです。
μgオーダーあるはずなのに。。

89 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 20:47:29
>>85
もう一度試してみるという選択は間違ってないと思うけど、
プレートからコロニーをピックアップして、振盪培養するとき、
アンピシリン入りの培地使ってないの?

90 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 20:57:40
http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/protocol/b10.html
この方法で一周PCRして、3塩基を置換しようとしています。
PCR後、泳動して確認すると、元のプラスミドよりも少し大きい位置にバンドが現れました。
置換後でも塩基長は同じになるはずなので、同じ位置に出ると思っていたのですが、これって反応がうまくいっていないのでしょうか?
それとも、テンプレートのプラスミドは大腸菌から抽出したものなので、PCR産物の環状DNAとコイルの仕方が違ったりするのでしょうか?

91 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 21:29:11
>>90
PCR産物のプラスミドのバンドは何本?

仰せの通り 元とPCR産物にある微妙な構造の違いで
バンド位置が変わったり
或いは複数のバンドが見られることがある様なので
まだ試していなければですが
何かしらの制限酵素で鎖状にしてから
一度コントロールと流してみて下さい。

92 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 21:44:36
>>91
複数の置換変異体を作ろうとしているのですが、いくつかの変異体では、
かなり低分子量側にうっすらバンドがもう一本見えるものがありました。
ただし、メインのバンドはすべての変異体に共通した位置に出ていて、
ちょっと当たりっぽいかなと思っています。

とりあえず次の段階の形質転換と平行して制限酵素処理もしてみようと思います。

93 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 21:50:42
>>88
キャリアーを使えば?
キャリアーの自作が面倒だったらNIPPON Geneの「エタチンメイト」使うとか。

94 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 22:27:16
>>90
同じ鋳型から繰り返し複製することはPCRとは言わない。

95 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 22:30:21
>88
沈殿後に乾固させるじゃん?
あれ時間かけすぎるとDNAガチガチになって溶媒に溶けなくなるYO

または溶解用のTEにDNaseがコンタミ…はないかさすがに
うっかりDNase活性殺してないRNaseをTEに溶かして使ってたとか
(↑まさかと思うだろうが、俺はやった)

低レベルな回答ですんません

96 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 22:30:30
>>84
フェノールorフェノール・クロロホルム抽出+エタ沈は必要でしょ。
エタ沈は大胆にデカンテーションで上清を捨てた後、軽く遠心して
チューブに残った50ul程の上清を、ペレットを吸わないようにピペット
チップで除くというのが最強。

97 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 00:27:50
二次元電気泳動→PVDF膜にブロット→免疫染色→スポットを切り出す→抗体をストリップ→メンブレン上で消化してTOF-MSで同定

っていう感じの実験をしたいのですが可能ですか?
ストリップをちゃんとやらないと抗体等の混入が心配ですがどうでしょう

98 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 00:31:54
免疫染色の時点でブロッキングに使用するスキムミルクやBSAが、、、

99 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 00:40:06
>>97
なんでそんな面倒なことするのか分からない。immune precipitationか抗体カラムつくって一発だし、
どうしても2次元電気泳動したいならその後にもできるし。

100 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 00:51:58
>>98
それが一番心配な点なんですが有機溶媒やらで丁寧に洗ったら何とかなりませんかね?

>>99
もちろんIPと抗体カラムは試しましたが
「目的タンパク質がごく少量しか存在しない」&「抗体価が弱い」
というダブルパンチで上手くいきませんでした

101 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 03:34:24
発現系次第だが収量を増やす努力も同時平行で行うこともお勧めする。

102 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 23:52:29
BluscriptのEcoRIとBamHIをラーゲーションし、
その後大腸菌にトランスフォームした場合、
Bluescriptのダイマーを形成し、大腸菌の中で複製していくと考えていいのでしょうか?

103 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:31:43
>>102
日本語でおk

104 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:36:58
いや、日本語的にはまあまあだと思う。

105 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:37:39
いや、意味不明。

106 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:40:21
そのくらい読み取ってやれよ。うちの学生なんてもっとヒドいけど、何とか対処してやってるぞ。

107 :102:2006/11/24(金) 00:42:55
Bluescript is linealized with EcoRI and BamHI,
and the resultant DNA is done ligation,
and then transformed into E.coli.
In that case, the plasmid, as a dimer, is replicated in E.coli?

108 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:46:19
惜しい!

109 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:47:44
日本語で意味不明だったところが英語でもダメ。

110 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:57:04
そういうのが取れたことはないから、現実問題としては「まず無い」と言っていいと思うけど、
プラスミドの複製という観点で何か不都合あるかな。
全体が巨大なinverted repeatで不安定だろうけど、それは複製の問題とは別だもんな。

111 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:57:12
>>102
なにが目的でどんなことを知りたいのかわからない。
まずBluscriptのEcoRIサイトとBamHIサイトはライゲーションしない。
DNAってダイマーを形成するの?

112 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 01:03:04
EcoRI-EcoRI、BamHI-BamHIでライゲーションされた2倍のサイズの産物が
大腸菌内で安定に複製されるかって質問でしょ。

113 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 01:13:13
oriが二カ所あるプラスミドは安定して増えない

114 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 01:16:04
>110
ご回答ありがとうございました。
>111
ライゲーション時に、ベクターのみのコントロールを取る事があると思いますが、
その理由をきちんと抑えておきたかったので。
>112
そういうことです。
>113
ありがとうございます。

115 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 01:33:16
>109
113の日本語を英語に訳してみてよ。明日の正午までに。
君のすばらしい英語の回答を、ノートに書き込んでおくよ。

116 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 09:02:18
>>115
極端に長い inverted repeat のある配列は、大腸菌では増えない
ようです。プラスミドが逆向きにつながると 約3kbの inverted
repeat になってしまうので、増えません。プラスミドがタンデムに
つながったダイマーなら普通に複製できます。指定された>>113
英訳ではないが、
So plasmids with two ori sequences can be stably maintained
in E. coli.

最初の質問では、EcoRI と BamHI で二重切断したものを
ligation したのか、EcoRI で切ったものと BamHI で切ったものを
ligationしたのかがわかるように書かないといけないよ。

EcoRI digest and BamHI digest of pBluescript were
ligated, and then the ligation products were introduced
into E. coli. Is the resultant dimer molecule of
pBluescript replicates in E. coli?

117 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 09:23:34
can → cannot かな?

118 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 22:48:45
>>117
pBR、pUC、pBluescript などのColE1系のプラスミドなら can。
F因子などのstringentなプラスミドならcannot。


119 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 22:56:08
ナメクジのパッチクランプ

120 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/25(土) 10:52:09
パッチクランプについて詳しく教えてください

121 :102:2006/11/27(月) 06:49:05
>116, 118
Wow! Thanks a lot.
Brilliant!

122 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/27(月) 12:31:15
>>119=>>120?
ナメクジでうまくいってないのか?そうなのか?えれーえ難しそうだけど、エレガンスのペーパーならあるっぽいよ。
哺乳類の脳神経のvivo-patchってのも出来るそうだし。

123 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/30(木) 10:16:23
国内でPhi-NX Cellを提供してるラボってありますか?
nolan-labに直接だとMTAがめんどくさい・・

124 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/30(木) 22:10:16
実験の副手やってる院生が嫌いです・・・

「お前ここはOOしたほうがいいに決まってんだろ!」
「な? あ? そうだろ?」
「それならなんでお前今XXしたん??」
「こうしたほうがいいだろ? おい? な?」

実験中は胃が痛くなります。
私の実験が下手だというのもあるでしょうが、これは耐えられません。
どうすればいいでしょうか

125 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/30(木) 22:28:52
>>124
俺はしがない助手だが
いまどき親しくも無い学生をオマエ呼ばわりしただけで
アカハラ認定ですよ。
学生にはみんな敬語で丁寧に話してます。

上司に相談すべし。

上司が取り合ってくれなかったら、
あなたが強くなるしかないでしょう。
ある程度のストレス耐性がないと仕事なんてやっていけませんからね。
自分が向上していくチャンスと考えて前向きに行きましょう。

126 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 01:58:50
最近の顕微鏡に附属のソフトを使えば、
簡単に緑と赤と・・をmergeすることが可能ですが、
まだお持ちでない方もいるかと存じます。
そこで、Photoshopを使ってFITCとRhodamineをmergeする方法を
アップしました。
この方法で以下のようなmerge画像が得られます。
http://133.95.84.77/~sheel/merge/example.jpg

「Photoshopを使ってFITCとRhodamineをmergeする方法」
http://133.95.84.77/~sheel/merge/howtomerge.pdf

以下のURLからFITCイメージとRhodamineイメージの例を
ダウンロード可能で、これを使用して実際にmergeの練習ができます。
http://133.95.84.77/~sheel/merge/exampleimages.zip

merge結果が以下の画像となります。
http://133.95.84.77/~sheel/merge/merge.jpg

127 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 10:36:13
Windowsで動くフリーのプライマー作製ソフトってありますか?

128 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 17:19:52
>>124
ぬるぽ。
最近の若い子って免疫ないのね。
うちのラボなんか教授が機嫌悪い時は口きいてくんなかったり
モノ飛んでくるのは当たり前ですよwww
基本的に(相手が横柄でも)教わってる、という立場としては
それを是としたほうが良いと個人的に思います。
ただ、よほど嫌なら>>125の言ってるように教授に相談してみる
と良いでしょう。


>>127
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi


129 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 21:49:19
>>124
「ここはOOしたほうが」「それならなんで」「こうしたほうがいいだろ」
にちゃんと反論できるようになれば立場は変わる。
それが出来ないならおとなしくしてなさい。
これは実験が上手いとか下手とかいう問題じゃない。

130 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 23:27:10
>>124
そういう奴はむかつくがちゃんと教えてくれるだけマシと思え

>>127
http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm

131 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/02(土) 04:33:16
>>124
そういうのはな
「はぁ、そうだったんですか。気づきませんでした。勉強不足ですみません。
 ありがとうございます。他に気をつけるべきことはありますか?」
くらい聞いてちょうど良いんだよ。

教えてもらえるだけありがたいと思えwwww

で、もし反論出来るだけの根拠があるなら
「確かに○○も一つの手とは思いますが、私は〜〜の根拠に基づき、XXをしました。
 もし不備があるのでしたら、原理説明をお願いします」
くらい言え。ただし、君の知識が毛頭ないのに、注意されたくないだけとか言うくだらない
自尊心からくるだけの反抗なら、下手に出とけ。

132 :124:2006/12/02(土) 17:04:57
スレ違いなのにお答えくだすった皆さんありがとうございます。

いろいろあったけど、私は元気でした

133 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/02(土) 17:23:04
魔女宅オチかよ・・・・・

134 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/03(日) 08:55:00
過去形か。

あの世から乙

135 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/03(日) 10:31:37
>>126
http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1036510268
こちらへ...

136 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/04(月) 18:17:05
基本的な質問で申し訳ないのですが,2mm四方程度のマウス組織から(一応これらの組織の
数は10個程度までは増やせそうです)RNA抽出して、アレイに持っていきたいのですがなか
なか収量が稼げません。一応TorizolやRneasy等は試してみたのですが。。。

一応可能であれば、one-cycleでやるため1-5μg程度は必要で、two-cycle(10-100ng)も
考えています。どちらにせよ100ng以上ほしいのですが。。。何か良いアイディアありますか?

137 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/05(火) 11:10:07
そもそもその体積の組織標本に含まれる以上のRNAはとれないが、
その辺は押さえているのだろうか?
いや詳しくは知らんが。

138 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/05(火) 20:03:54
以前、カメの採血方法を質問したものです。
今回、カメの採血に成功しました。
単純にカメの後ろ足を1cmほど切って、
ポタポタ法で採血しました。
その後はsacrifyしますた。

以上、報告まで。

139 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/05(火) 20:10:09
>>138
そんなこといちいち報告すんなやボケ!
あー胸糞悪い!

140 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/06(水) 10:06:42
>>139
なにファビョってんの?

141 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/06(水) 10:57:14
どうせSacrifyするなら、暖冬して逆さ釣り。そん時に頚動脈や頚静脈とか当たりつけておいて次はカニュレーションに挑戦

142 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/06(水) 23:22:21
まな板の上に乗っけてね
甲羅にお湯かけて
首がニューと伸びてきたところを
こう
包丁ですぱーんと
あと
ちっちゃなグラスに血を採ってからね
焼酎で薄めてお出しします


143 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/06(水) 23:27:38
>>142
それは実験じゃなくて調理という。

144 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/07(木) 02:14:52
どうも。現スレ >>5 です。

お陰様で30℃培養でpETに目的の遺伝子を正しい方向に挿入することが出来ました。
有り難うございました。

抗生物質耐性遺伝子以外は同じプラスミド両方で実験をしてみて、コロニーの当たりの
確率を見て思ったのですが、毒性の高い遺伝子は KanR のプラスミドよりも AmpR の
プラスミドに入りやすいということはありますか?

あと、私は、他の仕事の合間にやってて遅くなったのですが(言い訳w)、皆さん、
発現系ってだいたいどのくらいの時間で構築できるものなのですか?



145 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/07(木) 23:34:36
>>144
>毒性の高い遺伝子は KanR のプラスミドよりも AmpR のプラスミドに入りやすいということはありますか?
そんなの聞いたことないけどなあ
他のベクターの特性じゃない?

>発現系ってだいたいどのくらいの時間で構築できるものなのですか?
cDNAから釣ってくるところから始める場合は2〜3週間ぐらいかな
まあ、サイズとか制限酵素サイトとかにもよるけど

146 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 03:15:19
カナマイの濃度下げると取れることは確かにあった。

147 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 22:13:21

T7とかSP6とかのRNApolymeraseでin vitro transcriptionすると、必ずバンドが二本出るんだが、
あれってなんなの?

148 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 23:13:58
転写産物+鋳型

149 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 23:24:20
ンなわけねえだろカス
二次構造だよ

150 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 23:28:33
サイズの小さなコロニーを選んでピックアップするとインサート当たりが良かったことがある。

151 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 00:28:40
俺もそれは聞いたことがある
インサートが入ってる分だけ負担が大きい(?)からだとか

ただ、小さいのはサテライトの可能性もある

152 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 00:39:01
LB plateじゃなくてM9 plateを使うとインサートのあたりが増えることがあるよ

153 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 13:31:23
逆に大きい方が当たったりする事もあるらしいがな、
抗生物質の効きが弱い時は。

154 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 13:56:13
>>152原理はどう説明つける?
いや証明しなくてもいいのだよ、
それなりに納得のいく説明なら。

155 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 17:53:35
誰か、NEB社のGPS-M Mutagenesis System(トランスポゾンを飛ばすやつ)を使って、
ゲノムライブラリーに変異を導入した人いませんか?
全く変異が入らず、早1ヶ月。
このキットで成功した人がいたら、いろいろ聞きたいんですが、
よろしくお願いします。

156 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 17:56:30
>>154
経験則に原理説明ってのは、非科学的だな。

157 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 10:10:44
>>156 何を言っているやら。
ある面白い現象を見つけた何度か再現をとる、
そして再現性がみられるなら原理の仮説を立て、
仮説を検証できる実験系を構築し実験をし、
その結果から仮説が正しいかどうか考える。
サイエンスそのものだろ。

別に証明しなくていいっていってるさ、それは時間も金もかかる。
本業でなければそんな手間はかけれない。
でもなぜそうなるのか、仮説を立てるのは暇な時間にできること。
ちょっとした気晴らしみたいなもんだ。
それをここに書きこんでくれたら、
みんなであーでもないこーでもないとヨタ話ができる。

158 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 12:50:19
あるタンパクのリン酸化部位の同定を目指しています。
そこでGST融合タンパク質を作成し、それを基質にしてKinase assay を行いました。
その融合タンパク質の全てのリン酸化可能な残基に変異を導入したにもかかわらず、
リン酸化されてしまいます。GSTがリン酸化されている可能性はありますか。
ほかに何か原因があるのでしょうか。どなたか経験のあるかたアドバイスください。

159 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 12:56:46
リン酸化されたと結論したその実験の詳細を述べるべき。

160 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 12:58:56
pGEXの空べくたーから発現させたGSTがリン酸化されることはよくある

Hisx6タグベクターに移せ

pQE9がお勧め

161 :158:2006/12/10(日) 14:05:19
もう少し詳しく述べると、
目的タンパク質の部分配列35アミノ酸をGSTに付加しGSHビーズでタンパクを
精製しました。それを32P-ATP 存在下に細胞ライセートと混和し30度30分
インキュベートした後PAGEで展開しオートラしました。
ネガコンのGSTのバンドは検出されませんが、目的タンパクの野生型、変異型
ともに同程度の強さのバンドが検出されました。変異型は全てのSer,Thrを
Alaに変えてあります。Y はありません。
タンパクまたはペプチドの融合でGSTのリン酸化が促されるということはあるのでしょうか。

また、短い断片なのでGSTをタグに泳動で確認したいのですが、Hisで発現させると
Kinase assayはPhospho-celluloseを使ってスポットの検出になるのでしょうか。
よろしくお願いします。


162 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 23:25:59
0分はどうかな

163 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/11(月) 07:43:28
Native−Page
発現させたタンパク質を変性させないで電気泳動するなんてどう?
非還元SDS−PAGEでもいいと思う。
同一ゲルでサンプルの処理方法を変えて流してみるというのも面白そうだね。
PAGEで展開されたそうだがどのようなPAGEだったのかがわからないから何ともだけど。

164 :158:2006/12/11(月) 09:53:32
>>163
少し分りにくいので教えてほしいのですが
泳動の条件を変えることでどのような結果が期待されるのでしょうか?

ちなみに、サンプルは数回ビーズを洗浄した後に
サンプルバッファーを加え還元条件でボイルしました。
電気泳動は12%SDS−PAGEです。
クマシーで染色後、ろ紙上で乾燥させてからオートラです。

165 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/11(月) 10:08:32
GSTだけだと内在性キナーゼの親和性が低くてGST自体のSer/Thr側鎖も基質にならんけど、
Ser/Thrを潰したpseudo基質配列を融合したGSTの場合、内在性キナーゼとpseudo基質ペプチド
強く結合したんで、そのキナーゼが手近にあるGST自体のSer/Thrを無理矢理リン酸化したんだろうか。


166 :158:2006/12/11(月) 11:17:52
ご意見ありがとうございます。
キナーゼの特異性はそんなものなのでしょうか?
それと、もしご存知なら教えてもらいたいのですが、
キナーゼ結合部位とそのリン酸化部位は近くかほぼ同じと
私も認識していますが、どれくらいの範囲なのでしょうか。不勉強ですみません。
BamH1を使ったのでそれがコードするSerが10アミノ酸ほど上流にあります。
これを潰してみようと思いますが、だめなら手を変えてみます。

すでに結構な時間を費やしたのでGSTを捨てるのはおしいのですが、仕方ありません...
なにかアイデアがあればよろしくお願いします。

167 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 11:06:07
俺は詳しくないのであまり真に受けないでほしいが、
>>160が経験者のようでよくあるとのこと、
彼のHisにしろ、というのはもっとも良さそうなアドバイスに見える。

あるいは可能性は低いがGSTフュージョンに結合する、
似たようなサイズのものが検出されているとか。
これを検証するにはライセートとP32ATPのみでリン酸化反応をし、
カイネースインヒビターいれてから、
あるいは酵素が働かない低温にしてから、
GSTフュージョンを混ぜるというのはどうか。

168 :158:2006/12/12(火) 12:07:24
実際にいくつかの非特異的なバンドも見られますから、似たようなサイズのものを見ている
可能性は否定できませんね。いろいろコントロールをたててまたやってみます。
タグを換えるのも前向きに考えます。

169 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 14:51:50
MAPK系を動かす受容体シグナルを入れようと思い、EGFRを過剰発現させたところ、
リガンドを添加していないのにMAPKが活性化してしまいました。
EGFRはどうやら局所濃度依存的に活性化されてしまうらしいのですが(1)、このせい
でしょうか?
だとすると、何かもっといい受容体はありませんか?
過剰発現してもまったく影響がなくて、リガンドを与えた途端にドラスティックにMAPK
が動き出すような。
できれば膜一回貫通型がいいです。

(1) Cell. 2006 Jun 16;125(6):1137-49

170 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 15:22:50
PMAでもぶっかけたら?

171 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 16:10:11
>>170
いやー、訳あって、膜を介する受容体シグナルでないとまずいんです。
EGFなら一番有名だからOKかな〜と軽く考えていたんですが。。

172 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 19:40:27
>>169
培地の血清は抜いたよね?

173 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 20:38:44
インスリン受容体でもあかんのけ?>>171

174 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 20:47:26
>>172
Yes, of course!

>>173
インシュリン受容体ってバックグラウンド低いですか?
だったらいい感じですが。

175 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 23:11:29
>>174
大気中のヴィスファチンが結合するのでバックは決して低くないって
シモピーズが言っていたぞw

176 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 23:26:41
過剰発現する必要はあるのか?

177 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 10:07:21
おはようございます。

>>175
ヴィスファチンってなんだか分からなかったのでググってみましたが・・・
大気中・・・!?

>>176
それが、あるんです。。
詳しくは実験のコンセプトを口外できないので言えないんですが。

とりあえず、FGFRかTGFβRあたりでやってみようかと思ってます。
免疫系の受容体なんかもいいですかね?

178 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 12:03:58
そんな研究はアーティファクトを報告するだけじゃないのか?

179 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 13:52:42
>>178
生理現象を明らかにする研究ではなく、技術開発なんです。
もちろんアーティファクトはあっては困るんですけど。

180 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 22:48:39
エタ沈用に
エタノールと酢酸ナトリウムをあらかじめ混ぜて保存しとくのってOK?
なんか害ある?

181 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 23:26:38
>>180
エタ沈の原理を勉強してから出直して来い

182 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 23:43:02
>>180
okだったはず。俺もやってるし

183 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 23:47:41
酢酸ナトリウムが沈殿しないか?

184 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 23:54:39
酢酸エチルができそうな気がしないか?

185 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/14(木) 00:17:34
俺も気になる
説得力のある答えきぼんぬ

186 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/14(木) 00:18:38
ナメクジの実験がことごとく再現できない

187 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/14(木) 00:31:36
粘着してるね。で、主犯は誰なの?

188 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/14(木) 00:38:29
まずは偉そうな>>181に答えて欲しいね。

189 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 03:16:11
>>180
混ぜとくってのは普通だけど、それで放置はどうか知らん。
一日くらいなら大丈夫な気はするが、作り置き放置プレーは保証できない

190 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 15:40:19
>>180
まーあれだ。
特に問題なさそうな気がするんだが、結局のところ

   お 前 が 人 柱 に な れ

ってことだな。
結果レポよろしこ。

191 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 16:46:21
ネットでしらべたけど、イソプロとNaOAc混ぜると沈殿するけどエタノールの時は大丈夫らしいね
でも昨日プレミックス作ってシーケンスサンプルエタチンしたけど、フリーのdNTPに比べてシグナルのピークが弱かったんだが、、、、
1000bまでは読めてたけど、、、

192 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 17:01:19
まぁその都度混ぜた方が無難ではあるよね

193 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 17:21:27
プロフ見てくれた?プロフの写真からメッセージ下さいね
http://kurabujp3.nobody.jp/

194 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 00:25:19
というわけでさらしあげとく

>>181
>>181
>>181
>>181
>>181
>>181
>>181

195 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 00:52:25
初級の分子生物学実験の話題になるととても偉そうに痛いこと書き込む
奴が現れるよね。

196 :182:2006/12/16(土) 01:59:25
>>191
イソプロは駄目なのか!
今まで普通に使ってて、沈殿も見たこと無いけど・・・。
明日、沈殿してるかしっかり確認してみよっと。

結局塩無しのエタノールもよく使うから、
混ぜてても場所とるだけで、あまり意味ないんだよな。
塩の量の計算もめんどくさいし、エタ沈するときにも
入れる量の計算が微妙だし・・・

197 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 09:29:18
塩入れなくても結構沈殿するからね
多少はロスってるかもね

198 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:10:32
相違や最近はほとんどエタ沈してない。
ミニプレで磯プロ賃だから塩なんか半年ぐらい入れてないや。

199 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:18:23
もうすぐ卒論提出のおれに質問させてください。

おれは精巣を解離して、特定の細胞だけを極細のピペットで一個ずつ何百個か回収して、
その細胞で特異的に発現しとる遺伝子を見つけたいなって思ってる学部4年です。

それで、回収してきた細胞を固定して切片にしてHE染色して、精巣の組織切片
と比較した上でちゃんと目当ての細胞だけを集めたってことを示す必要があると
思うんです。

でも細胞をシングルで(または数十個まとめて)固定すると収縮してしまって、
組織切片での像とかなり変わってしまうので困ってます。
回収した細胞を低融点ゲル(pH、浸透圧ともに調整済)に入れて、冷やして
固めてそれを固定→切片というふうにやってます。
固定液を色々変えてみたのですが、いい切片像は得られませんでした。

できる限り組織切片での像と同じような像をシングルの細胞でも得られるように
する為に、何かいい方法はないでしょうか。

200 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:31:05
>>199
血球細胞の回収に使うサイトスピンっていう遠心機を使って
スライドグラスに回収した細胞を貼り付けて染色しなさい。
免疫とか血液をやっているラボなら必ずあるから、探して借りなさい。
切片でやっている限りはきれいなデータにはならないよ。

201 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:42:51
>>200
レスありがとございます。サイトスピンですか、調べてみます。
その方法で染色したとして、何と比較すればいいのでしょうか。
組織切片に似たような像にはならないですよね??

202 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:46:32
>>201
精巣の細胞だから核の形で分かるだろ。
これは切片だろうが回収した細胞だろうが基本的に変わらん。

203 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:47:00
俺はHE染色像でやる必要性がいまいちわからない。
HE染色以外にその周辺にある細胞と区別する方法が、
全然ないのだろうか?
モノクロとかとれていないのか?

204 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 13:11:55
>>202
確かに細胞懸濁液の状態でも核の形態から、たぶんこれが目当ての細胞だろうとわかるのですが、
確たる証拠が要るのではないかと考えています。
これまでに精巣構成細胞の同定は精巣の組織切片上でしか行われておらず、細胞懸濁液での
同定は例がありません(たぶん・・・)。ボスに見てもらっても、細胞の大きさ、核の形態
から言って「たぶん」間違いないだろうとは言われるのですが、ほんとうに間違いないのか
が気になるんです。

>>203
モノクロというとモノクローナル抗体ってことですか(知識なくてすいません。。)?
現在はまだ見つかっていないです。僕も分子マーカーがあればと思ったんですが、
ないのでやはり組織切片像に似せるしかないかなと思っています。


>>203

205 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 13:49:12
へー、精巣ってそんなレベルだったんだ。
すげー意外。

206 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 13:53:49
組織上での鑑別ではHE染色のみでやってるの?免疫染色ではなくても、
色々な染色法による染色性の違いなんかはないのかな。

207 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 13:55:03
>>205 はっきり言ってやれよ。もっと調べろ、と。

208 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 14:01:59
>>207
1970年代のような錯覚を覚えたw

209 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 14:07:20
なにそれ?

210 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 15:12:35
精巣の細胞って、歳暮細胞か?支持細胞だとしたらLeidig細胞かSerotri細胞か?
いずれにしても、マーカーが無いとはとても思えないなw

211 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 16:53:03
>>206
これまでHE染色のみでした。染色法を変えることは考えていなかったので、
ほかの染色法についてもしらべてみます。ありがとです。

>>210
第一精原細胞です。もしかしてマーカーあるんでしょうか。
調べ方が足りなかったかもです。すいませんもっと調べてみます。

212 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 19:49:27
レプトテンとかザイゴテンかな

213 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/17(日) 16:11:54
  

214 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/18(月) 15:21:41
色々なタンパク(リン酸化タンパク含む)のウェスタンに使えるブロッキング剤を
探しているんですが、市販品でお薦めありますか?
今みたところこういうのがあるようなんですが、いいですかね?
http://www.funakoshi.co.jp/h_news/0410/041025_PCCs.php

215 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/18(月) 17:56:04
>>214
たっけー!
研究室お金持ちならいんじゃね?

216 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/19(火) 00:31:12
>>214
成分無調製豆乳

217 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/26(火) 16:45:04
制限酵素配列付きプライマーでのRT-PCRで取ってきた遺伝子がデータベースと違う部分が
ある上に、使う予定だったレアな制限酵素配列付きになっていました。

・ポイントミューテーションで予定外の制限酵素サイト潰す
・別の制限酵素サイト使ってPCRから

などが思いつきますが、どっちが楽でしょう?
また、ほかにもっと良い方法ありますか?

218 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/26(火) 17:15:10
>>217
TOPOクローニング

219 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/26(火) 19:09:17
オリゴ注文

220 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/26(火) 19:09:48
pcrの

221 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/27(水) 00:16:29
>>220
なんだそれ
気になるじゃねぇかw

222 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/28(木) 15:04:47
>>217
俺も最近はTOPOとGatewayばっか。
制限酵素なんて久しく使ってねえな。

223 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/29(金) 18:00:05
96welフォーマットで、均一で簡便にある程度質のいい、
プラスミドを抽出できるキットはなにかありませんか?
今使ってるpurelinkはムラがあるんだけど、培養方法が悪いのかな

224 :223:2006/12/29(金) 18:36:04
ムラってのは、プレートの左か右が、ごそっとシーケンスで読めない
泳動してないからプラスミドがとれてないのかどうかしらんが
培養はTB培地、タイテックの水平偏心運動で1000rpmで16時間くらい
これは培養のせいなのかキットのせいなのか

225 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/29(金) 22:30:40
ここで聴くよりまず泳動しろよ、な。

226 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/30(土) 00:25:38
>>225
知らないんなら発言しなくていいよカスwwww

227 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/30(土) 00:39:07
カスはテメエだろが。
プラスミドが取れてるかどうかで、
可能性の範疇が全然違うことも分からんのか。

人には向き不向きがあるんだってことが、今日よーく分かったよw

228 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/30(土) 01:02:33
やったことがある人ならその辺も含めてわかるよ
知らないことにまで口だそうとするなよ低脳www

229 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/04(木) 11:39:05
>217 亀レスだが
まず内部の制限酵素サイトが運良くメチル化で切れない状況になってないか調べる
駄目ならクローニングに使ったベクターのMCSの酵素が使えないか調べる
それでも駄目なら元々使いたかった酵素の2箇所の内側で切れる酵素を使って
インサート断片を二つに分けて次に入れたいベクターと3ピースライゲーション

230 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 06:22:33
(質問1)
細菌からDNAを抽出するときの
100度で熱抽出のプロトコールを教えていただけませんか?
また、熱抽出するメリットやデメリットも
よかったら教えていただけますと幸いです。
(PCRのかかり具合が良い、など)

(質問2)
血液を
proteinaseK+lysisBufferで一晩放置後にフェノクロしてイソプロ抽出
してみましたけどなんか純度が悪いのかPCRがうまくかかりません。
血液からDNAを抽出するときって、キット以外の正攻法としては
どんなのがありますか?

231 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 06:33:52
全血はあかん
遠心分離して血球だけにしてやってみ
それでもだめなら
ヘパリン入れて静置して白血球だけ取り分けて
やってみ

232 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 10:55:45
学校で、豚の目と、鶏の脳の解剖したせいで、お肉があまり美味しく頂けなくなった。
目に剃刀を入れたときに出る液体や、頭蓋骨を外すときの音、豚さんと鶏さんの匂いがフラッシュバックする……

233 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 11:36:08
>>228
わかるよ、じゃねえよカスw
シークエンスも満足に出来ねぇクズのくせによw

234 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 12:25:59
>230 アルカリ法とBoil prepでプラスミド抽出する場合の比較かな?
Boil Prepの利点
・試薬が安価かつ1.5mlチューブで培養からDNA保存まで兼用できて経済的
・操作工程が短く楽チンで速い。まとめて作業するのに向くので手作業でも48サンプルとか余裕。

デメリット
・若干DNAが汚い(ABIのシーケンスキットはそのままでは
反応がかからないので、以下とは別の変法も作った)

PCRに関してはColony PCRでもおkだし、DNAを十分薄めればかかると思う
漏れが常用してるプロトコルはこんな感じ
1) 1.5mlチューブでLB1.0mlでO/N culture(12h以上)
2) 遠心して培地をアスピレーターで吸って捨てる
3) 100μl STET + 10μlリゾチームでVoltex(完全に懸濁させる)して一呼吸
4) 35秒煮えたぎる熱湯の中につけて引き出す
5) 軽く2回程度shake(ゲノムDNAを軽く切断してペレットをコンパクトに)
6) 10分間最高速(14krpm程度?)で遠心
7) ペレットをつまようじにくっつけて除く
8) 110μl イソプロを加えて良く混ぜて一呼吸
9) 10分間最高速で遠心
10) 液をアスピレーターで吸って捨てる
11) 70%エタノール500μlを入れペレットとチューブ全体をwash
12) 5分間最高速で遠心
13) 液をアスピレーターで吸って捨てる
14) 乾燥後、40μl TE/RNaseに溶かして完了
試薬など ttp://cancer.ucsd.edu/howelllab/Mini%20Prep%20by%20Boiling.html

235 :230:2007/01/06(土) 17:08:46
>>231
ありがとうございます。
全血はダメなんですね・・・。
なんかめんどくさいのでやっぱりキットでやってみます。
>>234
ありがとうございます。
アルカリ法しか知らなかったのですが、
論文読んでると熱抽出とか書いてあって単にラクチンかな、
と思ったので・・・。
プロトコルまでいただいて感謝です!
やってみます。

236 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 21:49:03
最近の学生はプロトコールブック一つ読まないで
ネットの掲示板で質問するのか・・・・・

237 :230:2007/01/08(月) 11:21:51
>>236
プロトコールブックっていうのがあるのですか?
上記のDNA熱抽出が載っている本があったら教えろや、カスが。

238 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 11:45:50
>>236
 
ま、ゆとり教育世代は__揃いだから仕方ないんじゃない?www

239 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 12:48:51
えー?>>237って本当に>>230
もしそうならちょっと良くないよなって自分でも思うでしょう。
こういう人っていて当然なの?>>教員の方
それならやっぱり院にいる人ってちょっとへん。

240 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 13:17:58
なにいってんの?
最近の学生は年上にため口聞いたり掃除当番すっぽかしたりするような奴ばっかりだよw


241 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 13:31:30
うーむ。やっぱ一万人計画はダメだな。
教えてもらう人にカスとか、信じられん。

242 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 13:48:59
皆様釣りはスルーで。<カス

243 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 15:37:48
ところで細菌培養のときに培地に均等に塗るためのあの先が三角形みたいになってるガラスのバーってなんていうんだっけか?

244 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 16:05:00
先が三角形みたいになってるガラスのバー
だろ

245 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 16:16:06
>>244
おいおい、嘘教えるなよw

正解は「上手く塗布できる棒」、通称「うまい棒」だよ

246 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 16:46:55
すぷれっだー
自作するんだよ

247 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 17:38:31
コンラージ棒って呼ぶ人もいるでよ

248 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 21:41:40
コンラージ棒、略して「こん棒」

249 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 23:09:34
俺は自分の如意棒で塗ってるけどな。

250 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 02:22:34
>>249
まき終わったらちゃんと火であぶって滅菌しとけよw

251 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 12:13:21
>>249-250
弁当噴いたwwwwwww

252 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 12:49:28
>>249
当然エタノールに漬けるんだよな?

253 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 14:27:09
>>249
それはなんていう性病の検査なんですか?

254 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 20:32:49
「のびろ、如意棒ォーーーーッッッッ!! ・・・・・・・ダメだ、のびねえ」

255 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 21:04:58
>>252

ヘネシー・フェラ?
ナポレオン・フェラ?
VSOP・フェラ?

256 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 23:18:06
>>255
男なら「まむし焼酎」

257 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 04:15:14
サザンのメンブレン(ナイロン)をリプローブしたいと思っています。
皆さん推薦のプロトコールありませんか?


258 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 04:19:47
PCRしろ

259 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 08:56:05
誰か、selectionするときのG418濃度教えてくれ
使ってる細胞はHela
kill curve作るのめんどくせえ

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